无忧论文网
当前位置: 无忧论文网 > 自然科学论文 > 医学论文论文 > 口腔医学论文 > 在牙胚发育晚期Shh可能参与了成釉细胞和成牙本质细胞分化
点击提交论文指导需求
高薪诚聘老师
在牙胚发育晚期Shh可能参与了成釉细胞和成牙本质细胞分化
时间:2011-07-24 浏览次数:1325次 无忧论文网
点击这里在线咨询我

关键词:信号分子 Sonic hedgehog(Shh) 牙胚发育晚期 基因表达 原位杂交 口腔医学论文代写   中国论文 职称论文

【摘要】口腔医学论文代写目的:观察信号分子Sonic hedgehog(Shh)在小鼠下颌第一磨牙牙胚发育晚期基因表达,探讨其在成釉细胞、成牙本质细胞分化中的作用。方法:制备昆明小鼠磨牙牙胚发育晚期(E16.5~P1.5)标本,用原位杂交法分析ShhmRNA在牙胚中的表达和分布。结果:ShhmRNA在牙胚发育晚期的前成釉细胞和中间层细胞呈阳性表达,在成牙本质细胞层表达较弱。结论:在牙胚发育晚期,Shh可能通过自分泌途径和旁分泌途径,参与了成釉细胞和成牙本质细胞分化。

 

【关键词】信号分子;Sonic hedgehog(Shh);牙胚发育晚期;基因表达;原位杂交;小鼠  

 

哺乳动物牙齿发育过程中,外胚上皮和外胚间充质的相互作用调控了细胞生长和分化,最终成长为具有特定形状、大小和功能的器官。上皮-间充质相互作用 的实现依赖于多种信号分子在组织之间进行的信息传递[1]。Sonic hedgehog(Shh)是一类在胚胎发育过程中起关键作用的信号分子,转基因鼠实验发现,Shh无效突变(null mutation)会导致底板、神经管、体节和肢体发育的严重障碍,造成死亡[2]。牙胚是研究器官发生的良好模型。研究表明:Shh在牙胚发育早期上皮 -间充质和上皮-上皮之间的信号传导中发挥重要作用,特别是调控上皮和间充质细胞的增殖,诱导早期牙形态发生[3]。牙胚发育晚期Shh是否参与了上皮- 间充质之间的信号传递,作为一种信号分子启动成釉细胞、成牙本质细胞的分化过程尚未知。
本研究旨在利用原位杂交技术检测牙胚发育晚期ShhmRNA的表达,构建晚期ShhmRNA时空表达模式,为进一步探讨Shh对细胞分化是否有作用及其机制奠定基础。

 

1 材料和方法

 

1.1 材料
通过交配成年昆明小鼠(湖北省医科院)获得不同胎龄的鼠胚胎。阴道栓出现的当日中午定为胚胎发育的第0.5天(E0.5)。拉 颈处死孕鼠,分离胚胎第16.5天(E16.5)至出生后1.5 d的动物下颌骨,立即置于新鲜配置的40 g/L多聚甲醛内,4℃固定24 h。100 g/L EDTA脱矿48 h。系列乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,5μm连续矢状切片,贴附于经20 g/L APES硅化和0.1 g/L PLL包被的玻片上,4℃保存备用。实验中所有试剂均由含DEPC水配制,以消除RNA酶的作用。

 

1.2 方法
1.2.1 探针制备
含有小鼠ShhcDNA的重组质粒pBluescriptⅡSK由哈佛大学Andrew McMahon教授惠赠。ShhcDNA片段大小为1 314 bp。探针制备方法与陈智等[4]描述方法一致。地高辛体外转录标记试剂盒购自德国Roche公司。基本步骤如下:①将质粒转化入大肠杆菌 JM109(QUICKTRANS,购自北京原平皓),挑取阳性菌落扩增,提取纯化质粒。②分别用限制性内切酶EcoRⅠ和PstⅠ(TakaRa,日 本)酶切消化,获得完全线性化反义、正义cDNA模板,质量浓度为1.0μg/μL。③分别用T7和T3 RNA聚合酶体外转录合成反义、正义cRNA探针,在体外转录的同时,加入地高辛标记物Dig -11-UTP进行标记。EDTA终止反应。④碱性水解探针至100 bp,冷乙醇沉淀,DEPC水溶解(20 ng/μL),-70℃保存备用。
1.2.2 原位杂交
实 验过程中设置了阴性组织对照和阴性探针对照。阴性组织对照片用蛋白酶K处理后,滴加RNase A溶液(15μg/mL),湿盒中37℃下处理30 min以去除组织中的mRNA,再滴加反义ShhcRNA探针。阴性探针对照采用正义ShhcRNA探针与切片杂交。超敏原位杂交及检测试剂盒购自美国 MBI公司,生物素化抗地高辛抗体购自美国Sigma公司,基本步骤遵循试剂盒操作手册。BCIP/NBT显色,核伊红淡复染,AEC封片,光镜下观察。

 

2 结果

 

E16.5~P1.5牙胚发育经历了钟状早期、钟状晚期、基质分泌期。ShhmRNA阳性信号主要位于胞浆内,为紫蓝色颗粒。
①钟状早期 (E16.5):此期成釉器进入成熟期,其凹面的形状已被确定。成釉器上皮细胞进一步分化,除外釉上皮、星网状层、内釉上皮外,在内釉上皮和星网状层之间 出现了1~3层扁平细胞,即中间层细胞。牙乳头被成釉器环绕。口腔上皮、内釉上皮层、外釉上皮层和中间层细胞中可见紫蓝色颗粒,前成牙本质细胞层及其内侧 的牙乳头表达较弱或无表达(图1,见彩色插页)。星网状层、牙囊中未见ShhmRNA阳性信号。与正义探针杂交的对照片及阴性组织对照片在此期及以后各期 均未见特异性杂交信号(图2、4、6,见彩色插页)。
②钟状晚期(E18.5):主要牙尖区域的前成牙本质细胞完成终末分化。内釉上皮细胞进一步分化为前成釉细胞,胞核远离基底膜。在此期,前成釉细胞和中间层细胞中均可见紫蓝色颗粒,牙尖、颈环处紫蓝色最深。成牙本质细胞层信号较弱(图3,见彩色插页)。
③基质分泌期(P1.5):主要牙尖区域形成一层前期牙本质,前成釉细胞完成终末分化。ShhmRNA在主要牙间区域的成牙本质细胞呈阳性表达,成釉细胞和中间层细胞中的杂交信号较前期明显减弱(图5,见彩色插页)。

关于我们 | 老师招聘 | 版权声明 | 联系我们 | 付款方式 | 返回顶部 | 

COPYRIGHT ©2001 - 2013 51LUNWEN.NET. ALL RIGHTS RESERVED.
【免责声明】:本网站所提供的信息资源如有侵权、违规,请及时告知
无忧论文网提供毕业论文指导 硕士论文指导服务