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高生物活性复合人工骨修复骨缺损的实验研究
时间:2011-01-23 浏览次数:1082次 无忧论文网
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高生物活性复合人工骨修复骨缺损的实验研究

[摘 要] 目的:探讨载有转化医学论文代写生长因子β1(TGF-β1),具有高生物活性复合人工骨修复骨缺损的价值。方法:建立SD大鼠下颌骨缺损模型。采用组织学和分子生物学Slot Blot杂交法,检测羟基磷灰石复合TGF-β1实验组,单纯羟基磷灰石对照组,无材料修复的空白对照组在骨缺损愈合过程中的组织学及Ⅰ型胶原mRNA的表达状况。结果:实验组的新骨形成及Ⅰ型胶原mRNA的表达水平最高。结论:提示载有TGF-β1的高生物活性复合人工骨局部使用能促进骨愈合。


[关键词] 下颌骨/外科学;羟基磷灰石类;转化生长β因子;胶原;基因表达;骨再生;大鼠
 [Abstract] Objective: To assese the value and clinical significance of bioactive material-hydroxyapatite (HA)combined with TGF-β1 in bone defect healing.Methods: The applicability of bioactive material-HA granules com-bined with TGF-β1 (group A) as a substitute for bone graft was observed in SD rat model. The results were com-pared with those of HA granules (Group B) and ungrafted bone defect (Group C).Results: Group A demonstratedthe highest level of typeⅠcollagen mRNA during healing period.Conclusion: The bioactive material-HA com-bined with TGF-β1 can efficiently bond to ongrowing new bone comparing to HA granules.
[Key words]  Mandible/surg; Hydroxyapatites; Transforming growth factor beta; Collagen; Gene expression;Bone regeneration; Rat[ J Zhejiang Univ (Medical Sci),2002,31(1):30-32.]  
近年来,随着骨缺损的发病率提高,其修复材料及骨愈合机制的研究已成为热点。不少学者在寻找新型骨修复材料同时,对骨生长因子的认识日益加深。Peter提出将高分子降解多聚颗粒作为释放转化生长因子β1(TGF-β1)的载体,体外调节成骨细胞的生长[1]。我们寻求将生物活性材料与骨生长因子以一定方式结合,体内局部应用修复骨缺损的方法。
1 材料与方法
1.1 实验材料  HPG0712型多孔羟基磷灰石(HA)颗粒(珠海丽珠公司),在经酸化激活的125μg/L TGF-β1(Sigma公司)液中浸泡吸附。
1.2 骨缺损模型建立及实验分组 选用SD大鼠68只(浙江大学医学院实验动物中心提供),雌雄各半,6~7周龄,体重180~250 g。实验动物按1 g/kg 1%戊巴比妥注入腹腔麻醉,无菌条件下,采用下颌下切口暴露下颌骨,分别在双侧下颌骨体部形成2 mm×6 mm×2 mm箱状骨缺损区,生理盐水冲洗,然后,按组植入材料,分为羟基磷灰石复合TGF-β1组(A组,28只),单纯羟基磷灰石组(B组,28只),不植入任何材料为空白对照组(C组,12只)。A、B2002年JOURNAL OF ZHEJIANG UNIVERSITY (MEDICAL SCIENCES)Vol 31  No 12002两组植入材料后,压实并用耳脑胶固定,C组分层缝合切口。术后肌注青霉素每日8万U 3 d。A、B两组分别于移植后1、2、4、8周取标本分4组,每组7只,另外,C组也按上述时间段分4组,每组3只。
1.3 探针  RatⅠ型胶原DIG标记的寡核甘酸探针[2,3],α1: 5′GCCGTCTTCAGAGCTGTAAACGTGGAAGCAAGGAGTCCC-3′,上海生工生物公司提供; Ratβ-actin 1:5′CAGAAGGACTCCTACGTG3′, Ratβ-actin 2: 5′GCTCGGTCAGGATCTTCATG3′,由浙江大学医学院传染病研究所合成。
1.4 标本处理及组织学观察 分别于术后1、2、4、8周处死动物,取下颌骨,切割骨缺损区外周1 mm的骨组织标本,一半标本保存于-80℃,取出另一半经4%多聚甲醛固定,0.5mol EDTA脱钙,石蜡包埋切片,HE染色,光镜下观察。
1.5  Slot Blot杂交 方法按文献[4],骨缺损区总RNA样本提取后,变性并于尼龙膜点样,装入RP648点样仪加样抽吸,80℃干烤;42℃预杂交;加入Dig标记的寡核苷酸Ⅰ型胶原探针[3],42℃杂交,膜于2×SSC/0.1% SDS,0.2×SSC/0.1% SDS漂洗;经bufferⅠ洗膜2min,bufferⅡ封闭30 min,bufferⅠ洗膜2 min,bufferⅠ稀释;anti-Dig-Ap反应1 h,bufferⅠ洗膜10 min×3次;bufferⅢ平衡5 min,NBT、bufferⅢ显色,避光反应,TE终止。杂交结束。杂交膜经光密度扫描,数据单位以每毫米面积的光密度比值表示。
1.6 统计学处理 采用SPSS-PC软件包,数值以x-±s表示,表1用多组方差分析后行q检验。
2 结 果
2.1 组织学观察  1周时A组、B组及C组缺损区均可见炎症反应,中性粒细胞浸润,A、B组材料组织界面有纤维组织长入,无骨形成;2周后A、B组HA微粒间及C组可见炎症细胞中度浸润,材料骨界面A组近骨壁处可见少量新骨形成,部分区域可见纤维样组织存在,B、C组未见新骨形成;4周后,A组、B组及C组局部炎症反应明显减退,A组材料骨界面近骨壁处新骨形成较多,近材料区纤维组织减少,B组新骨形成少于A组,C组部分新骨形成,缺损区域减少,骨组织边界不明显;8周时,可见B组材料骨界面纤维组织减少,新生骨增多,A组材料颗粒间被大量新生骨充满(图1),

C组缺损区域减少。箭头所指为材料骨界面区图1 A组8周时HA复合TGF-β1组材料颗粒间   被大量新生骨充满(HE 10×10)Fig.1  In group A, new bone filled      with HA grain in 8 weeks2.2  Slot Blot杂交 表1示A、B、C三组Ⅰ型胶原的mRNA表达水平比较有显著差异F=10.825,P<0.05;A与B组比较q=3.917,P<0.001;A与C组比较q=4.034,P<0.001。表1 1~8周植入区Ⅰ型胶原mRNA表达(x-±s)Table 1  mRNA expression ofⅠcollagen in        the implanted area (from 1 to 8 week)组别1周2周4周8周A组0.23±0.04 0.35±0.02 0.31±0.09 0.29±0.08B组0.11±0.08 0.10±0.03 0.20±0.01 0.26±0.07C组0.17±0.07 0.16±0.05 0.12±0.01 0.16±0.08   图2示骨缺损区Ⅰ型胶原mRNA表达的Slot Blot杂交结果。3 讨 论羟基磷灰石是一种不吸收的生物活性陶瓷,为晶体结构,摩擦系数及导热性与正常骨相似,具有良好的生物相容性。该物质有骨引导力,能直接与宿主骨形成稳定坚硬的骨性复合体[5],但缺乏骨诱导性,因此限制了其在临床骨缺损修复治疗中的应用。TGF-β是一族在细胞增殖、分化及功能过程中有基本调节作用的激素样活性多肽。其在增殖发生和组织损伤的修复与重建中的作用已引起人们的关注[6]。为改•31•             

      图中线条代表不同标本的杂交结果,1-4为1 w B组;5-7为1 w A组;8-9为1 w C组;10-13为2 w医学论文代写网http://www.51lunwen.net/medicalscience/ B组;14-17为2 w A组;18-20为2 w C组;21-23为4 w B组;24-27为4 w A组;28-29为4 w C组;30-35为8 wB组;36-39为8 w A组;40-42为8 w C组图2 骨缺损区Ⅰ型胶原的mRNA表达   的Slot Blot杂交结果Fig.2 

In Slot Blot hybridization mRNA expression      for ratⅠcollagen on defect area善羟基磷灰石表面的骨诱导活性,本研究将其作为TGF-β1的载体,进行骨缺损修复的尝试。采用的骨组织总RNA分析,尽管是半定量的,但对mRNA的检测是在同一张杂交膜上作一系列样本分析的,可排除探针之间的交叉。在组织学观察中,1周时A、B、C三组缺损区均可见炎症反应,中性粒细胞浸润,可见植入材料与创伤均可引起炎症反应。实验结果显示,三组间Ⅰ型胶原mRNA表达水平呈显著性差异,而且各组内在不同时间点的植入区Ⅰ型胶原的mRNA表达水平也呈显著性差异。骨缺损A组胶原mRNA表达明显高于其他两组,A、B组2周至8周时均逐渐走高。而C组2周时为高峰而后递减至8周又升高。这一结果结合组织学观察表明,复合TGF-β1的羟基磷灰石能刺激Ⅰ型胶原的表达,从而促进骨愈合。C组低于A组的Ⅰ型胶原mRNA表达趋势表明,材料的充填改变了骨缺损愈合自然过程。而大面积骨缺损无法自然修复愈合。一些实验表明,Ⅰ型胶原和成骨细胞的附着,伸展排列方向有密切关系,完整的Ⅰ型胶原可以和成骨细胞α1、β2整合素受体结合,并通过不同的信号途径发生作用[8]。Ⅰ型胶原为骨矿化提供基质,决定了新骨的性能,Ⅰ型胶原是骨组织中最重要的纤维胶原分子。因而,Ⅰ型胶原mRNA可以被认为骨形成及骨改建的分子标记[9]。有研究认为核因子-1(NF-1)是一刺激真核基因转录的DNA结合蛋白。TGF-β1在NF-1的介导下活化Ⅰ型胶原启动因子[7,10]。这与本研究的结果相符。本实验研究比较了大鼠下颌骨缺损区三种骨愈合模式的Ⅰ型胶原的mRNA表达。提示羟基磷灰石复合TGF-β1为具有高生物活性的复合人工骨。因此,我们认为由细胞因子和载体组成的具有生物活性的人工骨,将成为很有前景的临床应用材料。
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