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新型纳米微囊-VEGF复合体转染鼠成纤维细胞的体外试验研究
时间:2013-01-09 浏览次数:1033次 无忧论文网
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【中文题名】 新型纳米微囊-VEGF复合体转染鼠成纤维细胞的体外试验研究 【英文题名】 Study of a Novel Nanosphere Complexes-mediated VEGF Gene Transfection on Fibroblasts in Vitro 【中文摘要】 目的:探讨新型纳米微囊载体应用于基因治疗的可行性,安全性、转染效率、转移方法并与阳离子脂质体、质粒DNA进行比较。方法:以血管内皮细胞生长因子(VEGF_(165))为目的基因,构建真核表达载体pcDNA3.1/myc-hisA~-VEGF_(165),分别利用纳米微囊、阳离子脂质体介导VEGF_(165)转染鼠成纤维细胞(NIH3T3),转染4小时后镜下观察细胞转染后表型变化,48h后通过绿色荧光蛋白的表达观察瞬时转染效率,通过免疫组织化学、Western Blot检测基因表达水平及定位。MTT法检测对转基因细胞的毒性。ELISA检测经G418筛选后上清培养液VEGF蛋白持续表达情况。结果:经 【英文摘要】 Objective To investigate the feasibility, safety, transfe ction efficiency, and delivery method of a novel Nanosphere com plexes-Based gene therapy, compared with the Cationic Lipid, an d plasmid DNA. Methods After Reconstructing plasmid pcDNA3.1/m yc-hisA-VEGF165, Non-virual carriers was used to transfect the VE GF165 gene into the mice Vascular Endothelium Cell line(NIH3T3)b y nanosphere and cation lipofectin.The expression of VEGF165 gen e was examined by immunohistochemistry and fluorescence-microsc 【中文关键词】 基因治疗. 纳米微囊. VEGF基因. 【英文关键词】 Gene therapy. Nanosphere. VEGF165 gene. 缩略语表 6-007 中文摘要 007-009 英文摘要 009-11 前言和文献回顾 11-41 正文 41-55 1 材料与方法 41-42 1.1 材料 41-42 2 方法 42-48 2.1 大肠杆菌(TOP10)感受态的制备 42-43 2.2 pcDNA3.1/myc-hisA~- VEGF质粒转化大肠杆菌(TOP10)感受态 43-43 2.3 pcDNA3.1/myc-hisA~- VEGF质粒的少量制备 43-44 2.4 限制性内切酶酶切反应 44-44 2.5 人源性VEGF基因片段的检测 44-44 2.6 pIRES2-EGFP/VEGF质粒构建 44-44 2.7 细胞培养及G418浓度的确定 44-45 2.8 脂质体(Lipofectamine 2000)介导基因转染 45-45 2.9 纳米微囊介导基因转染 45-46 2.10 VEGF_(165)在细胞内表达的免疫组化检测 46-46 2.11 纳米微囊、脂质体介导的VEGF165蛋白表达水平的Western Blot分析 46-47 2.12 VEGF_(165)蛋白表达的ELISA检测 47-47 2.13 MTT法检测NIH3T3细胞体外对脂质体和10mM的纳米微囊介导pcDNA3.1/myc-hisA~-VEGF敏感性 47-63 3 结果 48-63 小结 55-056 参考文献 056-58 附录 58-62 个人简历和研究成果 62-63 致谢 63-63
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