无忧论文网
当前位置: 无忧论文网 > 自然科学论文 > 医学论文论文 > 口腔医学论文 > 广东省口腔医院对口腔链球菌的丙酮酸氧化酶基因的上游区序列的调控性和启动子活性
点击提交论文指导需求
高薪诚聘老师
广东省口腔医院对口腔链球菌的丙酮酸氧化酶基因的上游区序列的调控性和启动子活性
时间:2011-07-27 浏览次数:1507次 无忧论文网
点击这里在线咨询我

关键词:口腔链球菌 丙酮酸氧化酶 丙酮酸氧化酶基因 调节基因 广州论文 职称论文

 [摘 要]口腔医学论文代写目的:阐明体外扩增得到的口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因的上游区序列是否即是调控序列,是否具有启动子活性。方法:将口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因调 节区PCR扩增产物经HindⅢ酶切,克隆至载体PKK232-8,转化E.coliJM109,通过氯霉素抗性筛选阳性菌落,重新增菌后取质粒DNA, 再经酶切鉴定。将重组子点种于不同浓度的氯霉素平板上,37℃培养18 h,观察菌落生长情况,测定重组质粒转化子对氯霉素的抗性水平。结果:筛选得到1个阳性菌落,重组质粒DNA的酶切产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳,表明获得片段的Mr约为1.3 kb,与预计大小相符,证实其为阳性重组克隆。测定重组质粒转化子对氯霉素的抗性水平显示其抗性达1 020μg/mL。结论:本研究已成功克隆口腔链球菌丙酮酸氧化酶调节基因

 

[关键词]口腔链球菌;丙酮酸氧化酶;丙酮酸氧化酶基因;调节基因 

 

血链球菌和口腔链球菌等通过丙酮酸氧化酶使丙酮酸盐氧化产生过氧化氢[1],从而在拮抗牙周致病菌、维护牙周健康中起重要作用[2-4]。对基因表 达的研究表明,同一结构基因在不同宿主体内表达水平不同,除与相关调节因素有关外,还与启动子的存在和强弱有关。原核生物的启动子通常位于其编码基因的上 游,且二者相邻。为了阐明口腔链球菌等产生过氧化氢的调节机制,在对口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因(Sopox)成功克隆和序列分析的基础上[5],本课题 组对口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因的上游区序列进行了体外扩增,得到了2.3 kb左右的特异性条带[6]。但此条带是否即是调控序列,是否具有启动子活性,尚不明确。本研究将此片段克隆至专用于筛选启动子的启动子探针型载体 http://www.51lunwen.net/kouqiang/PKK232-8中,以明确该扩增片段中是否含有启动子活性片段,并同时对其启动子 功能进行初步了解。

 

1 材料和方法

 

1.1 菌种、质粒和试剂菌种E.coliJM109、启动子探针型质粒PKK232-8由华西医科大学感染免疫研究室提供。胶回收试剂盒(上海华舜公司),限制性内切酶和HindⅢ和EcoRⅠ(GibcoBRL公司),牛肠碱性磷酸酶、连接酶(大连宝生物公司)。

 

1.2 主要仪器高速台式冷冻离心机(美国Beckman公司),高速台式离心机(上海安科科学仪器厂),电泳仪(Biorad-Model 200/20,Biometra)。

 

1.3 扩增片段的克隆取1.5 mL的EP管2支,一支加入PKK232-8质粒DNA溶液(100μg/mL)4μL,另一支加入胶回收片段(200μg/mL)10μL,两管均分别 加入10×缓冲液7μL、HindⅢ3μL,以无菌水补足至70μL,37℃反应3 h。酶切完成后用2倍无水乙醇沉淀,10 000 r/min离心5 min,收集DNA,700 mL/L乙醇洗涤,干燥后溶解于50μL双蒸水中。取44μL溶于双蒸水的酶切完全的质粒载体DNA,加1μL牛肠碱性磷酸酶及5μL 10×缓冲液,37℃反应1 h,用等体积苯酚:氯仿/异戊醇抽提后,2倍无水乙醇沉淀,12 000 r/min离心10 min,700 mL/L乙醇洗净,干燥后溶于44μL双蒸水。在总体积为10μL反应体系中按比例(供体DNA与载体DNA摩尔比为3∶1)加入供体DNA及载体 DNA,再加入1μL DNA连接酶于16℃作用30 min。

 

1.4 转化E.coliJM109大肠杆菌的实验细胞制备参照《分子克隆技术》中CaCl2制备新鲜的感受态细胞[7]。取2μL连接产物于EP 管中,加入200μL感受态细胞,轻轻混匀,冰浴30 min,42℃热冲击90 s,冰浴2min,加入0.8 mL SOC,37℃振摇1 h,将菌体涂布LB平板(含氨苄青霉素20μg/mL)37℃培养18 h,至转化子长出。

 

1.5 重组克隆的筛选鉴定挑取琼脂板上的菌落接种于5 mL含抗生素(氨苄青霉素20μg/mL)的LB培养液中37℃振摇过夜,取适量菌液,抽提质粒DNA,以EcoRⅠ酶切,10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定,筛选阳性克隆。

 

1.6 重组克隆中启动子活性的测定取琼脂板上的菌落用无菌牙签接种于含氯霉素的LB琼脂平板上。37℃孵箱过夜,至重组子长出。将重组子点种于不 同浓度的氯霉素平板上,37℃培养18 h,观察菌落生长情况,测定重组质粒对氯霉素的抗性水平。以PKK232-8空质粒为阴性对照。

 

2 结果

 

2.1 重组克隆的酶切鉴定将PCR扩增后的口腔链球菌丙酮酸氧化酶调节基因2.3 kb片段行胶回收纯化后,经HindⅢ酶切,产生1.3 kb和1.0 kb两个片段。将酶切产物回收后与PKK232-8质粒DNA用HindⅢ单酶切后连接,转化E.coliJM109后,通过氯霉素抗性筛选得到1个阳性 菌落,重新增菌后取质粒DNA,再经酶切鉴定。酶切产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳,表明获得片段的Mr约为1.3 kb,与预计大小相符,证实其为阳性重组克隆(图1)。

 

2.2 重组克隆中启动子活性的测定结果将重组子点种于不同浓度的氯霉素平板上,37℃培养18 h,观察菌落生长情况,测定重组质粒转化子对氯霉素的抗性水平。结果重组子的抗性可高达1 020μg/mL。(A:空质粒DNA经HindⅢ酶切;B、D:重组质粒DNA未经酶切;C、E:重组质粒DNA经HindⅢ酶切;F:λDNA /HindⅢ)

 

3 讨论

 

目前所用的启动子探针型载体主要分为两类:第一类载体中用于分离基因启动子的报告基因,只除去了启动子部分,仍保留了完整的基因编码区和起始密码 子。第二类则不仅除去了报告基因的启动子,而且除去了基因起始密码子,甚至5′端部分编码区也被除去。在第一类载体的克隆位点插入一转录方向与报告基因一 致的含启动子的DNA片段,该报告基因就能表达。如果要使第二类载体的报告基因表达,插入的DNA片段不仅要含有启动子,还要和报告基因转录方向相同,而 且这一DNA片段还必须有翻译起始密码子,并且其相位要与报告基因相位保持一致。三者缺一不可,否则有启动子的报告基因也不会表达。本实验所用的启动子探 针型载体PKK232-8是Jurgen Brosins所构建的一系列启动子探针型载体比较有效的一个。该载体含有启动子缺失的氯霉素乙酰转移酶基因,在多克隆位点和cat 论文由无忧论文网www.51lunwen.net整理提供(仅供参考),如需转载,请注明出处。

关于我们 | 老师招聘 | 版权声明 | 联系我们 | 付款方式 | 返回顶部 | 

COPYRIGHT ©2001 - 2013 51LUNWEN.NET. ALL RIGHTS RESERVED.
【免责声明】:本网站所提供的信息资源如有侵权、违规,请及时告知
无忧论文网提供毕业论文指导 硕士论文指导服务