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创伤性休克时重要脏器一氧化氮合酶的变化及意义
时间:2011-01-23 浏览次数:1041次 无忧论文网
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摘 要 为了探讨创伤性休克时脏器一氧化氮合酶(NOS)的动态变化及NOS抑制剂、L-精氨酸对创伤性休克的治疗效果,作者复制了大鼠创伤性休克模型,检测创伤性休克后0•5h、3h、5h心脏、肺脏、小肠、肝脏、脾脏中iNOS和cNOS的变化;另外在休克后静脉予氨基胍(AG)、左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)、左旋精氨酸(L-Arg),检测大鼠脏器中iNOS和cNOS的变化,观察在给药后动物的生存时间和死亡率。结果表明,正常大鼠所有脏器均有cNOS表达,肝脏和肺脏还有少量iNOS分布。创伤性休克后0•5h几乎所有脏器cNOS有不同程度的提高,而iNOS却无明显变化;休克后3h,脏器中cNOS开始下降,而iNOS开始上升,到休克后5h,iNOS大量合成,与对照组比较差异显著(P<0•01)。AG和L-Arg明显延长了休克大鼠的生存时间,而L-NAME对生存率无影响。AG抑制了iNOS的合成,同时促进了cNOS的合成,L-NAME对两种NOS均抑制,而L-Arg对NOS没有影响。结果提示,iNOS在创伤性休克后期才大量合成,应用NOS抑制剂和L-Arg治疗休克必须视休克的程度、药物的剂量和给药时机而定。

  一氧化氮(NO)在休克的病理生理过程中发挥了重要作用,与休克后血管反应性下降、器官功能衰竭及死亡等密切相关[1]。创伤性休克属于低血容量性休克,不同于脓毒性休克及单纯性失血性休克[2]。以往的实验证明,创伤性休克后期复苏后NO显著增加[3]。本实验进一步研究创伤性休克时重要脏器各型一氧化氮合酶(NOS)的变化。

1 材料与方法

1•1 材料 健康SD大鼠,体重280±20g,雌雄不拘,由第一军医大学实验动物中心提供。乌拉坦(广州化学试剂厂,分析纯);氯醛糖(瑞士Fluka公司);枸橼酸钠(上海化学试剂公司,分析纯);NOS检测试剂盒(南京建成生物制品工程研究所);左旋精氨酸(L-Arg)、左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)和氨基胍(AG)均由美国Sigma公司提供。Glison生理记录仪(美国Glison公司);血压换能器P23ID(美国Gould-Statham);DU640核酸蛋白分析仪(美国Beckman公司)。
1•2 创伤性休克模型的制作 SD大鼠腹腔注射13•3%乌拉坦-0•5%氯醛糖6•7ml/kg全身麻醉,右侧颈动脉、颈静脉插管,分别用以记录血压和输液复苏,用3•8%枸橼酸钠抗凝。稳定10min,以2•5kg铁轮自30cm高处自由落下,致大鼠两后肢上端骨折,平均动脉压(MAP)降至60mmHg即认为休克开始(15~20min内不休克者弃用)。断肢结扎止血,一侧股动脉立即插管放血,使血压降至40mmHg,通过抽、输血维持该血压1•5h后予复苏。失血量为总血量的40%,回输抽的血液,以林格液补足失血量,再给总失血量1倍的林格液。拔管缝合,并缝合下肢创口。上述过程均无菌操作。
1•3 动物分组和检测方法
1•3•1 创伤性休克时脏器NOS的变化 SD大鼠分为对照组(假手术组)、休克0•5h组、休克3h组和休克5h组,每组各8只。对照组予颈动、静脉及一侧股动脉插管后处死,其他组大鼠在休克后相应时间处死,立即取肝脏、脾脏、肺脏、小肠、心脏,按1∶9比例加入匀浆缓冲液,冰浴下匀浆,充分研磨后,吸取标本,4℃14 000g离心30min,然后14 000g4℃超滤离心1h,滤液在-80℃保存备用。取50μl测蛋白含量,另取100μl测NOS活性,检测步骤严格按照试剂盒说明书操作,在530nm波长下测定吸光度,根据吸光度的大小计算出NOS活力。每毫克组织蛋白每分钟生成1nmol NO为一个NOS酶活力单位。
1•3•2 NOS抑制剂、L-精氨酸对创伤性休克大鼠存活率的影响 SD大鼠复制创伤性休克模型,分为对照组、AG组(100mg/kg)、L-NAME组(10mg/kg)、L-Arg组(100mg/kg),每组各10只。对照组予林格液复苏。其他实验组在予林格氏液复苏的同时经静脉回输各药液,药液量计入复苏液体总量。复苏、清创完毕放回笼内观察。计算24h存活率。
1•3•3 NOS抑制剂、L-精氨酸对创伤性休克大鼠脏器NOS的影响 分组及处理同1•3•2,每组各8只,在休克后5h处死,取脏器测NOS活性,脏器及检测步骤同1•3•1。
1•4 统计学处理 应用SPSS 11•0统计软件处理,行t检验、方差分析,生存率行χ2检验。

2 结 果

2•1 创伤性休克时脏器NOS的变化 对照组脏器中cNOS水平为肝脏5•27±0•16、脾脏6•23±0•26、小肠5•53±0•46、肺脏3•62±0•35、心脏5•24±0•32,肝脏、肺脏还可检测到少量iNOS(肝脏2•16±0•08、肺脏3•39±0•18),而脾脏、小肠、心脏未检测到iNOS;休克后30min,几乎所有脏器的cNOS均有不同程度的上升,其中肝脏5•88±0•54、小肠6•23±0•53与对照组比较P<0•05,而脏器中iNOS却无明显变化;休克后3h,所有脏器的cNOS都明显下降(肝脏3•37±0•66、脾脏1•80±0•35、小肠3•61±0•70、肺脏2•44±0•81),与休克0•5h组及对照组比较P<0•01,而脏器中iNOS开始上升(肝脏5•54±0•77、脾脏4•44±0•85、小肠3•42±0•98、肺脏8•31±1•25),与对照组及休克30min比较P<0•01;休克5h,脏器中cNOS仍在下降,分别为肝脏2•38±0•33、脾脏1•60±0•32、小肠2•83±0•40、肺脏1•70±0•52,与休克3h比较P<0•05,而脏器中iNOS却大幅度上升(肝脏15•51±3•02、脾脏13•88±2•21、小肠19•13±1•57、肺脏26•48±3•14),与休克3h比较P<0•01。另外,休克似乎对心脏的NOS无影响。
2•2 NOS抑制剂、L-精氨酸对创伤性休克大鼠24h存活率的影响 与对照组比较,AG组及L-Arg组的存活时间和24h存活率均明显提高。
2•3 NOS抑制剂、L-精氨酸对大鼠创伤性休克时脏器NOS的影响 予L-NAME后,与对照组比较,脏器中的iNOS和cNOS均明显下降(P<0•01);予AG后,iNOS明显下降,而cNOS却上升,与对照组比较有明显差异(P<0•01);予L-Arg后,无论是iNOS还是cNOS均无明显变化。

3 讨 论

有研究表明NO参与休克的病理生理过程,而两种NO合成酶cNOS和iNOS在休克过程中所发挥的作用也不尽相同。Star[4]认为,cNOS分泌的NO可以调节血管紧张度及血管渗透性,抑制血小板、中性粒细胞的聚集和黏附,在病理条件下表现为调节功能;而iNOS被炎症刺激、内毒素及细胞因子激活,所合成的高浓度NO参与对各脏器的损害。我们的研究显示,在正常对照组,所有脏器均有cNOS表达,说明cNOS在正常情况下就有一定量的表达,机体的大部分组织都持续稳定地合成NO。创伤休克早期,cNOS蛋白轻度增多,说明机体由于创伤出血、应激等原因,cNOS转录活性增强,cNOS蛋白合成增多,以适应神经、心血管、免疫功能调节的需要。而在休克中晚期,cNOS明显下降,是因为随着休克的进展,机体的缺血、缺氧加重可导致内皮源性NO的合成减少[5]。另外,休克后的再灌注损伤也可导致内皮细胞cNOS合成降低[6,7]。休克后3h,脏器中iNOS开始增加,到休克后5h,iN-OS大量合成。结合NO在创伤性休克后期血清中才开始增加[3],说明创伤性休克在休克中晚期确有iNOS的增加,并且iNOS的大量合成出现在休克晚期,与Kelly等[8]的结果一致。这与内毒素性休克iNOS的合成不同,在内毒素性休克时,由于炎症因子很早释放,NOS活性在休克后短时间被激活。而在创伤出血时,炎症因子释放较晚,它作为激活iNOS活性的主要因素,可能是导致创伤失血时iNOS合成较晚的原因。我们使用NOS抑制剂和L-Arg,发现L-NAME对休克大鼠的生存时间和生存率无明显影响,而AG和L-Arg却明显改善了上述指标。Hua等[9]应用L-NAME治疗失血性休克大鼠,可抑制NO合成,减轻组织、器官损伤,延长大鼠存活时间。Zingarelli等[10]也在实验中证实L-NAME可使休克大鼠主动脉环对去氧肾上腺素降低的反应性得以恢复。而另一些研究却发现L-NAME加重了休克后损伤。Denizbasi等[11]发现L-NAME可致休克后髓过氧化酶活性增加,加重了胃组织损伤,存活时间缩短。Harbrecht等[12]在休克后给予L-NAME,加重了肝脏损伤。我们认为,应用L-NAME出现了截然不同的治疗效果,与药物剂量和治疗时机有关。采取适合的剂量和给药时间,可能对休克治疗有效。L-Arg作为体内NO合成的惟一底物,近年被用来治疗休克,其作用也存在争议。Zingarelli等[10]应用L-Arg后,血管反应性降低更为明显,杨贵远等[13]也得出相同结论。Hua等[9]在研究中发现,L-Arg可缩短失血性休克动物的存活时间,而应用NOS抑制剂后存活时间得以延长。另一方面,Harbrecht等[12]近来证实在失血性休克的代偿末期给予NO供体减少了肝脏损伤,在同样的时段给予L-NAME却增加了肝脏损伤的程度。人们认为,L-Arg对休克治疗不利是因为它增加了诱导型NO的合成,导致机体器官损害加重,使休克病情恶化。而有利的原因是L-Arg同时使cNOS合成NO增多。我们认为,L-Arg的这种双重作用是由给药时间以及剂量决定的。因为iNOS的上升是在休克的晚期,如在iNOS已经大量表达的时间给予L-Arg,必然会加重机体的损害,而早期给予L-Arg,因为iNOS还未大量合成,L-Arg促进了cNOS合成NO,从而对机体起了保护作用。综上所述,创伤性休克后确实存在iNOS的大量表达,但不是在休克的早期,而在休克的中期开始,休克晚期达到高峰。然而,在应用NOS抑制剂和L-Arg治疗时,应该根据休克的程度,适当掌握药物、剂量和给药时机,才能取得好的治疗效果。

参 考 文 献
1 SzaboC, ThiemermannC. Invitedopinion: roleofnitricoxidein hemorrhag-ic, traumatic, and anaphylactic shock and thermal injury. Shock,1994,2(2): 145
2 Goris RJ. Pathophysiology of shock in trauma. Eur J Surg,2000,166 (2):100
3冯浩淼,黄宗海,黄绪亮等•大鼠创伤性休克后血清一氧化氮的动态变化及其机制.第一军医大学学报,2002,22(10):891
4 Star RA. Nitric oxide. Am J Med Sci,1993,306 (5): 348
5 Wang P,Ba ZF,Chaudry IH. Endothelial cell dysfunction occurs very earlyfollowing trauma-hemorrhage and persists despite fluid resuscitation. Am JPhysiol,1993,265 (3 Pt 2): H973

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