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创伤性休克大鼠血浆内皮素与一氧化氮的动态变化及L-精氨酸治疗作用的实验研究
时间:2011-01-23 浏览次数:1235次 无忧论文网
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摘 要 观察创伤性休克过程中血一氧化氮(NO)、内皮素(ET)与组织氧分压的动态变化,探讨L-精氨酸对创伤性休克的治疗作用。采用下肢创伤法建立创伤性休克大鼠模型,随机分为休克组与处理组,观察创伤前后血NO、ET及骨骼肌、肝脏、小肠的组织氧分压的动态变化,监测血流动力学变化并记录存活时间。结果显示,创伤休克后血NO、ET浓度显著高于伤前水平,休克后组织氧分压较创伤前显著降低;处理组复苏后5、12h血浆ET浓度显著低于休克组,复苏后各时间点血NO/ET值高于休克组,复苏后各时间点肝脏、小肠氧分压显著高于休克组,处理组12、24h存活率显著高于休克组(P<0•05)。提示血NO、ET分泌紊乱及NO/ET的失衡在创伤性休克过程中有重要的意义,应用L-精氨酸可减少ET的分泌与释放,使NO/ET值升高,改善肝脏及小肠的氧分压,从而改善创伤性休克大鼠的预后。

  内皮素(endothelin, ET)、一氧化氮(nitric oxide,NO)是迄今为止发现的作用最强的血管活性物质,生物学作用极其广泛,是调节血管基础紧张性的中心介质,其在脓毒性休克、失血性休克等方面的报道较多,但在创伤性休克领域尚缺乏系统研究。作者探讨了创伤性休克大鼠休克及复苏后血浆ET、NO与骨骼肌、肝、小肠的组织氧分压的动态变化规律,并观察了外源性L-精氨酸(L-argi-nine,L-Arg)对NO、ET及组织氧分压的影响,旨在进一步探讨NO、ET在创伤性休克病理生理过程中的意义及L-Arg的治疗作用。

1 材料与方法

1•1 实验动物 健康SD大鼠,雌雄不拘,体重250±20g,由第一军医大学实验动物中心提供。
1•2 试剂 ET-1放免试剂盒(解放军总医院东亚免疫技术研究所),NO试剂盒(美国Cayman公司),L-Arg(美国Sigma公司),磷光探针溶液(美国,Medical SystemsCorp,Greenvale,NY)。
1•3 仪器设备 LMS-2B型二道生理记录仪(成都仪器厂),SN-682型放射免疫γ计数仪(上海核福光电仪器有限公司),应用OxyspotTMphosphorimeter(美国,MedicalSystems Corp,Greenvale,NY)测定组织氧分压。
1•4 模型建立及实验方法 采用后肢创伤法复制创伤性休克大鼠模型[1]。大鼠腹腔麻醉后行单侧颈动、静脉插管,连接到LMS-2B型二道生理记录仪监测血压,稳定10min,以2•5kg铁轮自30cm高处自由落下击打大鼠双侧股骨中上段,立即监测血压,待平均动脉压降至40mmHg记为休克初,加压包扎双侧创面以减少进一步出血,通过放血或输液维持此低血压90min,记为休克末,在此期间行一侧股动脉插管以备放血或采血之用。之后回输估计失血量的3~5的平衡液进行复苏,使血压恢复至伤前水平的70%以上并维持。复苏前死亡的大鼠不计入本组实验,另取大鼠补充。动物模型随机分为休克组及处理组,处理组于复苏的同时予L-Arg 100mg/kg静脉注射,每组大鼠各42只,其中36只分别于创伤前、休克末和复苏后1、3、5、12h经股动脉取血测定NO及ET浓度,每个时间点各6只大鼠,另6只大鼠于相应时间点测定骨骼肌、肝、小肠的组织氧分压。大鼠取血后补充等量的平衡液,监测血压、心率、呼吸及肛温,记录存活时间。
1•5 血清NO(NO-3/NO-2)测定 股动脉取血后于4℃3 000r/min离心10min,将上清移入超滤离心管,在4℃14 000g离心25min,吸取滤液,用Griess法测定NO-2浓度,多孔酶标仪检测,制作标准曲线并检测样品,计算血清NO-3/NO-2浓度。
1•6 血浆ET浓度测定 股动脉取血2ml,注入含10%EDTA二钠30μl和抑肽酶40μl的试管中,混匀,于4℃3 000r/min离心10min分离血浆,-20℃保存。测定前置冷水中复融,再次在4℃3 000r/min离心5min,取上清100μl置于聚苯乙烯试管中,在SN-682型放射免疫γ计数仪上测定沉淀cpm数,根据有关参数,计算出标准曲线及样品浓度。
1•7 组织氧分压测定 大鼠置管后开腹,小心暴露小肠和肝脏,切开皮肤暴露大鼠前肢肌肉。按照20mg/kg的量通过颈静脉注入磷光探针生理盐水溶液,15min后使用OxyspotTMphosphorimeter开始测定骨骼肌、肝、小肠的基础值(伤前值),测定时探头距组织表面0•5cm。每次测定取值100次,每次做40个扫描,氧分压取其均值。创伤休克模型复制同上,分别在各个时间点测定骨骼肌、肝、小肠的组织氧分压。以上操作均在避光条件下完成。
1•8 统计学处理 数据以x±s表示,采用SPSS 11•0统计软件进行t检验、方差分析和χ2检验。

2 结 果

2•1 血清NO、ET浓度及NO/ET值的动态变化 休克组大鼠休克末及复苏后1h血清NO浓度与伤前无显著性差异,复苏3h后明显上升(P<0•05);创伤后休克组大鼠血浆ET浓度迅速升高,休克末达伤前水平的2倍左右,复苏后各时间点维持在高水平,同创伤前比较差异均有显著性意义(P<0•05);同休克组比较,复苏1h处理组血清NO浓度明显升高(P<0•05),而其他时间点差异无显著性意义;复苏5、12h处理组血浆ET浓度较休克组明显下降(P<0•05),其他时间点差异无显著性意义;处理组复苏后各时间点血NO/ET值高于休克组。
2•2 组织氧分压变化 休克及复苏后各时间点组织氧分压较创伤前低(P<0•05),复苏后虽血压回升亦不能恢复到伤前水平;同休克组相比,复苏后各时间点处理组骨骼肌的组织氧分压差异无显著性意义,而肝脏和小肠的组织氧分压明显升高,差异有显著性(P<0•05)。
2•3 对存活率的影响 处理组大鼠12h存活率(83•33%)同休克组(52•78%)比较差异有显著性意义(P<0•05),24h存活率(63•89%)同休克组(16•67%)比较差异显著(P<0•01)。

3 讨 论

本实验结果表明,创伤休克后及复苏后循环血NO、ET的升高是不同步的。休克后ET浓度迅速升高,复苏后各时间点仍维持在高水平;而NO浓度的升高相对较慢,复苏3h后才显著高于伤前值,这可能受多种因素的影响。休克后缺血缺氧对NO合成的影响目前存在着较多争议,越来越多的研究认为缺血缺氧可使NO合成增多[2~4];但也有研究认为休克后内皮细胞功能障碍可导致内皮源性NO的合成减少[5],而复苏时的再灌注损伤可导致肾、肝、心等脏器合成NO增多[6,7]。NO与ET在合成方面的相互关系目前已有较多的研究,但在结果方面也存在很多争议。血浆ET水平的升高可激活诱生型一氧化氮合酶(iNOS),使之大量表达,合成大量的NO。也有研究表明,ET-1可与内皮细胞膜上的ETB受体结合,使NO的合成和释放增加,应用ETB受体的拮抗剂阻断内皮细胞上ETB受体介导释放NO、PG2I,可以阻止血管舒张[8]。NO可抑制ET的合成与分泌,目前研究认为,NO抑制ET的分泌是通过下调ET的基因表达来实现的[9,10]。L-Arg为NO合成的前体,通过补充L-Arg可以调节内源性NO的合成和释放[11]。内源性NO主要由血管内皮细胞通过L-Arg-NO通路产生,在正常机体内有足够的L-Arg供应以合成NO,此时L-Arg不是NOS的限速因素,故在生理状态下增加外源性L-Arg不会增加NO合成,对血管不产生直接作用。在缺血、缺氧条件下,机体内源性L-Arg大量消耗,此时L-Arg可作为NOS的限速因素影响NO合成。外源性L-Arg可补充体内大量消耗造成的L-Arg不足,从而增加NO合成与释放,通过抑制内皮活化和机体的炎性反应来保护血管内皮功能[12,13]。本实验表明,应用L-Arg后血清NO浓度仅在复苏后1h显著高于休克组,说明外源性L-Arg促进NO的合成作用快速而短暂,但其可显著抑制休克后期ET的分泌。处理组血NO/ET值在复苏后各时间点均高于休克组,这也可能是改善休克预后的一个重要原因。本研究结果还表明,创伤性休克后肝、小肠、骨骼肌的组织氧分压明显降低,机体处于缺血缺氧状态,复苏后血压水平的提高亦不能使其恢复到伤前水平。应用L-Arg可明显改善内脏器官的组织氧分压,并能明显提高休克模型的12、24h存活率。外源性L-Arg改善内脏器官的组织氧分压可能与其促进NO的合成和释放、抑制ET的分泌以及调整血NO/ET值密切相关。

参 考 文 献
1孙英刚,黄宗海,冯浩淼等.创伤性休克大鼠模型的建立.解放军医学杂志,2002,27(12):1 086
2 Goris RJ. Pathophysiology of shock in trauma. Eur J Surg,2000,166(2):100
3 Gebhard F, Nussler AK, Rosch Met al. Early posttraumatic increase in pro-duction of nitric oxide in humans. Shock,1998,10(4):237
4 Angele MK,Schwacha MG,Smail Net al. Hypoxemia in the absence of bloodloss upregulates iNOS expression and activity in macrophages. Am J Physiol,1999,276(2 pt 1):C285
5 Wang P,Ba ZF,Chaudry IH. Endothelial cell dysfunction occurs very early fol-lowing trauma-hemorrhage and persists despite fluid resuscitation. Am J Physi-ol,1993,265(3 Pt 2):H973

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